Lipid-Auflösung in lebenden Zellen: Ein neuer Durchbruch in der hyperspektralen mittleren Infrarot-Fotoakustischen Mikroskopie

Lipide sind nicht nur strukturelle Bestandteile von Zellmembranen und Energiespeichermolekülen, sondern sie sind auch eng mit dem Auftreten und der Entwicklung von Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes,Herz-Kreislauf-ErkrankungenDie direkte Beobachtung und Unterscheidung der verschiedenen Arten von Lipiden in lebenden Zellen stellt sich jedoch seit langem technischen Herausforderungen.Traditionelle Leuchtstoffkennzeichnungsmethoden sind durch die Kennzeichnungseffizienz begrenzt, Spezifität und mögliche Störungen der zellulären Funktionen, während etikettenfreie optische Techniken oft Schwierigkeiten haben, Lipidmoleküle mit ähnlichen chemischen Strukturen zu unterscheiden.

Nature Methods hat eine Studie veröffentlicht, in der eine Technologie namens "Hyperspektral Fingerprint-Region Photoacoustic Microscopy" (hyFOPM) vorgestellt wird.Durch die Nutzung der Einzelbindung Vibrationsmodi in der mittleren Infrarot-Fingerabdruckregion, ermöglicht diese Technologie den Etikettenfreien Nachweis und die dynamische Bildgebung von Sphingomyelin (SM) und Cholesterin (Chol) in lebenden Zellen.

Technische Grundsätze
Die meisten etikettfreien optischen Methoden beruhen auf Signalen in der C-H-Stretchvibrationsregion (ca. 2800 ∼ 3000 cm−1), aber die Spektralbänder in dieser Region sind in verschiedenen Lipiden sehr ähnlich.Schwierigkeiten bei der Unterscheidung zwischen verschiedenen ArtenIm Gegensatz dazu enthält die mittlere Infrarot-Fingerabdruckregion (900 ̊1730 cm−1) mehr Einzelbindungsschwingungsinformationen, die die einzigartige Struktur von Molekülen widerspiegeln,wie die charakteristische Absorption von Amidbindungen, Esterbindungen und Steroidringe.

Das Design des hyFOPM-Systems konzentriert sich auf dieses Konzept. Es verwendet einen einstellbaren Quantenkaskadenlaser als Erregungsquelle und deckt den Bereich von 900 2932 cm -1 mit einer Spektrallauslösung von 2 cm -1 ab.Laserimpulse erregen die Probe und erzeugen photoakustische SignaleDas System verfügt über eine räumliche Auflösung von etwa 4,3 μm und ermöglicht eine Bildgebung auf der Ebene lebender Zellen.

Validierung von Lipidmodellen
Um die Machbarkeit der Technologie zu überprüfen, erstellte das Forschungsteam zunächst zwei-dimensionale Lipidlösungsmodelle mit Cholesterin (Chol), ungesättigtem Phosphatidylcholin (DOPC),und Sphingomyelin (SM).

(1)Vergleich der Spektralmerkmale

Die von hyFOPM gesammelten Fingerabdruckspektren stimmen sehr gut mit den ATR-FTIR-Ergebnissen überein.Cholesterin zeigt einen starken Absorptionsspitzenwert für die Steroidringdeformation bei 1056 cm−1; DOPC weist C=O Dehnungsvibration der Estergruppe bei 1731 cm−1; und Sphingomyelin entspricht dem Amid I-Band, Amid II-Band und der Fettsäure CH2 Biegevibration bei 1645 cm−1,1555 cm-1, bzw. 1464 cm-1.

(2)Spectral Unmixing und Klassifizierung
Bei Verwendung von nur 15 Wellenzahlen in der Fingerabdruckregion für die lineare Entmischung beträgt der Durchschnittssprechwert zwischen Cholesterin und Sphingomyelin nahezu 0%, während der Durchschnittssprechwert für DOPC 23% beträgt.Die Überspannung steigt bei Verwendung von 7 Wellenzahlen in der C-H-Stretchregion signifikantEine weitere Anwendung der linearen Diskriminationsanalyse (LDA) zeigt, dass die durchschnittliche Klassifikationsgenauigkeit bei Verwendung der Fingerabdruckregion oder der C-H-Region 96% erreicht.und erreicht 97% bei Verwendung aller Wellenzahlen.

(3)Modelle der riesigen einläufigen Vesikel (GUV)
In der Studie wurden drei Arten von GUVs zur Simulation von Zellmembranen vorbereitet: Modell 1, eine 1:1-Mischung von SM und Chol, die eine dichte geordnete Membran bildet; Modell 2, ein 2:21 Mischung aus DOPC, SM und Chol, die in flüssig geordneten und flüssig ungeordneten Phasen koexistieren; und Modell 3, reines DOPC, das eine ungeordnete flüssige Membran bildet.Die von hyFOPM bei 2852 cm-1 erfassten Bilder stimmen morphologisch mit denen überein, die durch Nilrot-Fluoreszenzfarben ermittelt wurden.Die Spektralleigenschaften verschiedener Vesikel entsprechen reinen Lipiden, was bestätigt, daß einzelne Komponenten in gemischten Membranen identifiziert werden können.

(4)Anwendungen für die Qualitätskontrolle
Durch Spektralmessungen an 10 verschiedenen GUVs für jeden Typ und die Erstellung von ternären PhasendiagrammenDas Forscherteam stellte fest, dass die tatsächliche Lipidzusammensetzung von der Zielquote abweichte (eine Diskrepanz von etwa 40%)Dies deutet darauf hin, dass hyFOPM für die Qualitätsbewertung bei der Herstellung von GUV verwendet werden kann.

Anwendung in lebenden Zellen
In der Studie wurde hyFOPM weiter auf lebende Zellen angewendet und die dynamischen Veränderungen von Sphingomyelin und Cholesterin in zwei Zellmodellen beobachtet.

(1) Akkumulation von Sphingomyelin in A549-Zellen
Die menschlichen Lungenadenokarzinomzellen (A549) wurden mit der Antitumorverbindung 2-Hydroxyoleinsäure (2-OHOA) behandelt, die voraussichtlich die Akkumulation von Sphingomyelin induziert.Fingerabdruckspektren (1600 ∼1400 cm−1) wurden aus 50 Zellen gesammelt., zeigt, dass die Spitzenfläche von 1464 cm-1 nach der Behandlung um 117% erhöht wurde, verglichen mit nur 23% in der Kontrollgruppe im gleichen Zeitraum.Die Bildgebung wurde an 3000 Zellen durchgeführt, wobei nur vier Wellenzahlen (2852 cm−1 für die Gesamtfette) verwendet wurden.Die Ergebnisse zeigten, dass das Sphingomyelinsignal nach 48 und 72 Stunden nach der Behandlung weiter anstieg.Während das Cholesterinsignal keine signifikanten Veränderungen zeigte.

(2) Cholesterinbelastung in HEK-Zellen
Die menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK293) wurden mit einem Methyl-β-Cyclodextrin-Cholesterin-Komplex (MβCD-Chol) koinkubiert, um den Cholesterinspiegel in der Zellmembran zu erhöhen.Spektren der Fingerabdruckregion von 50 Zellen zeigten, dass sich die Spitzenfläche von 1048 cm-1 nach der Behandlung um 161% erhöhte., während der Spitzenwert von 1464 cm-1 für Sphingomyelin leicht abnahm, was mit der bekannten Eigenschaft übereinstimmt, dass Cyclodextrin einige Membranlipide extrahiert, während es Cholesterin liefert.Die Bildgebung mit mehreren Wellenzahlen von 3000 Zellen bestätigte weiter die Erhöhung des Cholesterinsignals, mit einer leichten Erhöhung des Gesamtlipidsignals und geringen Veränderungen des Proteinsignals.

Bedeutung und Aussichten
Diese Studie zeigt die Fähigkeit, Lipidmoleküle mit ähnlichen chemischen Strukturen in lebenden Zellen ohne Kennzeichnung zu unterscheiden.Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, die auf Fluoreszenz- oder Isotopenkennzeichnung beruhen, vermeidet hyFOPM Probleme wie Kennzeichnungseffizienz und Störungen der Zellfunktionen,und seine Selektivität kann flexibel an die Spektralmerkmale der Ziellipide angepasst werden, indem die Aufregungswellenzahlen angepasst werden.

Die Spektralspezifität des derzeitigen Systems in der Fingerabdruckregion übertrifft die der C-H-Reihe, was Möglichkeiten für die Unterscheidung mehrer Lipid-Subtypen eröffnet.Die Studie weist auch darauf hin, daß die Kombination fortschrittlicher spektralerAußerdem kann die mittlere Infrarot-Fotoakustische Mikroskopie eine Bildtiefe von mehr als 150 μm im Gewebe erreichen.und zukünftige Anwendungen können auf dicke Proben oder in vivo-Einstellungen ausgedehnt werden. technologische Beschleunigung (z.B.Spektralunterprobung) und Systemminiaturisierung sind wichtige Richtungen für die Weiterentwicklung dieser Technologie in Richtung Point-of-Care-Analyse oder Routine-Labortests.